世界卫生组织指出：超重和肥胖是全球引起死亡的第五大风险。

器官间的交流对于控制和维持能量、新陈代谢和免疫稳态至关重要。此类交流中断的表型后果是肥胖，这是全球主要的公共卫生和医学问题之一。然而，器官间通讯在肥胖发病机制中的中心机制和作用尚未完全阐明。到目前为止，已经有几种治疗和预防药物用于肥胖管理，它们可以增加能量消耗，减少脂肪吸收、能量摄入和食欲。然而，这些药物有一些副作用，如心血管、精神和胃肠道不良事件。最近，益生菌通过改善肠道菌群组成、抗定植现象和各种代谢物（例如短链脂肪酸和维生素）的产生来控制肠道菌群，作为预防肥胖的有益药物受到了广泛关注。Akkermansia muciniphila（A. muciniphila），被广泛认为是下一代益生菌，可以逆转HFD引起的不良反应。考虑到A. muciniphila对氧气的敏感性及其在给药过程中的功效降低，最近的研究表明使用其非活性形式或其衍生物而不是其活性形式。应该注意的是，副益生菌（细胞结构成分）和后生元（益生菌分泌的代谢产物）是两种形式的非活性益生菌，当以足够的量给药时，可能对宿主健康产生有益影响。研究表明，与活体相比，巴氏杀菌的A. muciniphila对新陈代谢有更显著的影响，并且可以减少体重增加并增加总能量消耗。肠道微生物群与宿主的相互作用和多种信号通路的调节是由纳米级细胞外囊泡（EVs）的分泌触发的，它可以穿过粘液层并通过循环转移到外周组织。在这方面，许多研究报告了肠道微生物群衍生的EVs对改善几种疾病的积极作用。然而，需要进一步的研究来确定微生物群EVs在预防疾病中的确切机制。尽管已经对A. muciniphila细胞、片段和蛋白质在各种疾病模型中的影响进行了几项研究，但尚未报道A. muciniphila衍生的EVs、巴氏杀菌和活细胞的系统比较。因此该研究旨在使用明确定义的饮食诱导肥胖模型来展示活的和巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs在预防体重增加、炎症和脂质代谢方面的最佳效果，另外还旨在比较活的和巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对预防肥胖的影响。

A. muciniphila 培养及其EVs制备：A. muciniphila MucT（ATCC BAA-835）在基础粘蛋白培养基中生长到细菌密度OD₆₀₀为1后，通过离心去除沉淀，洗涤两次，并用厌氧PBS重新悬浮。剩余的上清液在超速离心机中以200000 g在4 °C下提取EVs 2小时, 提取后分别使用扫描电子显微镜（SEM）和SDS-PAGE评估EVs的形态和蛋白质的分子量。巴氏杀菌的A. muciniphila在70 °C下进行30分钟。

动物实验：将35只8周大的雄性C57BL/6小鼠单独饲养，随意获取食物和高压灭菌水，环境：（22–24 °C、40–60%湿度和12小时光照/黑暗）。以正常饮食（ND）（A03，安全饮食，法国）适应一周后，将小鼠随机分成五组（n = 7），给小鼠喂食HFD（260 HF，60%的能量来自黄油 (Kcal/kg)，安全饮食，法国），并进行五周的治疗，包括：(1) ND（标准饮食+200 µl PBS）（作为对照）; (2) HFD（HFD+200 µl PBS）（作为对照）; (3) HAm（HFD+10⁹ CFU/200 µl活A. muciniphila）; (4) HPAm（HFD+10⁹ CFU/200 µl 巴氏杀菌A. muciniphila）；(5) HEV（HFD+10 µg蛋白质/200 µl EVs）。每周测量体重并每天监测食物。收集血液、附睾脂肪（eWAT）、肝脏和结肠组织进行血清学和组织学分析。

选定基因表达的计算：国家生物技术信息基因表达综合中心（GEO）用于下载基因表达数据集，纳入标准如下：（1）小鼠喂食 HFD 4-6 周；（2）每组（即ND和HFD）的样本数必须多于一个；（3）利用肝组织；（4）评估所有选定基因的表达。获得一共四个数据集符合我们研究条件，用R（3.6.1版）统计计算环境和BioConductor（3.12 版）用于基因微阵列分析。

通过实时定量PCR分析结肠、脂肪和肝脏中的靶基因以及粪便中的肠道微生物群丰度。

图上 热图和PCA相关性显示HFD和ND小鼠之间涉及脂肪肝的不同肝基因

图下 活的、巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对HFD喂养小鼠肝脏中肝损伤相关基因的体重、病理学和表达的影响

HFD喂养后，肝脏脂质代谢相关基因（例如ppar-γ和lpl）的表达上调，而angptl4的表达下调。有趣的是，所有治疗都具有降低脂质相关基因的作用。在HFD组中观察到tgf-β的表达水平最高，而所有治疗都阻止了这种上调；然而，与HAm组相比，HPAm和HEV组中tgf-β显著下调。在喂食HFD的小鼠中，il-10的mRNA水平表达较弱，但治疗可能通过高il-10水平的表达发挥抗炎作用。有趣的是，EVs显示出最高的抗炎作用。总之，这些结果表明A. muciniphila可以预防HFD诱导的脂肪肝。

由于HFD会引起HFD喂养小鼠结肠形态、完整性和炎症的改变，因此通过H&E染色和qPCR评估了结肠组织。HFD诱导结肠固有层和上皮炎症细胞的局灶性浸润；相反，所有治疗均未出现炎症反应。此外，HFD组的隐窝深度和粘液层厚度显著降低，相比之下，所有治疗都阻止了这些变化。

HFD通过下调zo1、ocldn和cldn-1以及增加cldn-2表达降低肠道完整性，而在所有处理后都观察到这些基因的调节。在HEV组中观察到zo-1和ocldn的最高增加，但在HAm组中观察到cldn-1的最大上调。此外，在HEV和HPAm组中观察到更多的cldn-2下调。这些结果表明，紧密连接基因的调节是所有治疗抑制HFD诱导的肠道通透性降低的原因。

HFD上调结肠炎症标志物的表达，而所有治疗都可以防止这些变化，这些观察结果伴随着上调tlr-2和il-10以及下调tlr-4和tnf-α。EVs对降低炎症基因mRNA水平的影响最大，而活的和巴氏杀菌的A. muciniphila的tlr-2和il-10表达分别增加更多。这些发现表明，巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对HFD诱导的肠道改变的保护作用明显更大。

为探索活的和巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对脂质代谢的影响，评估结肠种血管生成素样4（Angptl4）基因的表达发现，HFD组结肠中angptl4的表达降低，而治疗组显著上调，其中HEV组效果更好。总之，EVs通过调节参与肥胖和能量代谢的基因对预防肥胖产生了显著影响。

图上 活的、巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对HFD喂养小鼠结肠形态、完整性和炎症的影响

图下 活的、巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对HFD喂养小鼠附睾白色脂肪组织中的体重、形态、肥胖相关基因和炎症介质的影响

为评估活的和巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs是否对HFD引起的脂肪功能障碍具有预防作用，通过组织病理学分析、qPCR和ELISA评估eWAT发现，HFD增加了脂肪细胞的大小，而所有治疗都对该参数产生了预防作用。在HEV、HPAm和HAm组中，脂肪细胞大小减小；HEV组表现出与ND组相似的正常形态。此外，与其他治疗相比，HFD增加了间质组织中炎症细胞的浸润。然而，与HPAm组相比，HAm和HEV组的炎症减轻较少。

脂肪细胞表面积结果显示，与其他组相比， HFD组的平均值最大（5613.71 ± 114.29 µm²）。此外，与HFD组相比， HEV (1170.19 ± 72.38 µm² )、HPAm (2349.31 ± 33.45 µm² ) 和HAm (2452.21 ± 124.36 µm² ) 组的脂肪细胞表面积分别显著减少。

HFD组显示出比ND喂养小鼠更高的eWAT重量。然而，所有治疗都显著阻止了这种体重增加，EVs对它的影响最大。这些发现表明A. muciniphila及其EVs通过影响eWAT重量在预防HFD引起的肥胖中发挥关键作用。

与正常小鼠相比，HFD喂养小鼠的eWAT中脂质氧化基因即ppar-α的表达降低。所有治疗都可以上调这种表达。然而，HPAm没有显示出显著变化，EVs对它的影响最大。此外，lpl和tgf-β在HFD组中的表达明显高于ND组。HPAm和HEV组对lpl表达的降低具有相同的作用，但 HAm对其没有显著影响。在所有治疗组中都观察到tgf-β的显著下调，而EVs和活的A. muciniphila显示出更明显的效果。

在HFD喂养的小鼠中观察到脂肪炎症基因（包括tlr-4、il-6和tnf-a）的过表达，而治疗减轻了脂肪炎症。在所有处理中均观察到tlr-4和tnf-α的表达降低相同，在HAm组中观察到脂肪il-6的 mRNA水平降低最多。

此外，在HFD组中还观察到TNF-α和IL-6水平升高，IL-10水平降低，而所有治疗均防止 HFD诱导的脂肪炎症。值得注意的是，巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对炎症介质浓度的影响最大。这些结果表明，后生元和副益生菌A. muciniphila可以预防HFD诱导的脂肪炎症。

为探索A. muciniphila是否可以调节HFD介导的肠道微生物群失调，通过实时PCR分析16S rRNA基因靶向门和组特异性引物量化小鼠肠道中的微生物组成。与ND组相比，HFD显著增加梭杆菌门和厚壁菌门，并减少拟杆菌门、放线菌门和疣微菌门。所有治疗都会影响肠道微生物群的组成，HPAm和HEV组的厚壁菌门丰度降低，而HAm组的疣微菌门丰度增加。另一方面，巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs显著降低厚壁菌门/拟杆菌门的比率。与 ND 组相比，HFD组的γ-/ε-/α-变形菌纲、肠杆菌科和梭菌纲的丰度显著增加，而瘤胃球菌科的丰度显著降低。五周后，HPAm组的α-变形菌纲、HAm和HEV组的γ-变形菌纲、HPAm和HEV组的普雷沃菌科和HEV组的梭菌纲显著下降。在属水平上，HFD组的肠道微生物群中罗氏菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属和大肠杆菌水平最高，而韦荣氏球菌属、另枝菌属、双歧杆菌属、甲烷短杆菌属和A. muciniphila的水平最低。有趣的是，活的A. muciniphila在预防这些HFD引起的生态失调方面最有效，伴随着另枝菌属和A. muciniphila的增加，以及罗氏菌属和大肠杆菌的减少。巴氏杀菌的A. muciniphila也显著降低了罗氏菌属的丰度。总体而言，A. muciniphila可以通过减少与肥胖相关的致病菌和增加与健康相关的肠道微生物群来避免HFD引起的生态失调。

图 活的、巴氏杀菌的A. muciniphila及其EVs对肠道微生物群模式的影响

肠道菌群与肥胖相关指标之间的相关性表明，厚壁菌门与脂肪IL-10水平和结肠il-10表达呈负相关，而与肝脏tgf-β表达呈正相关。拟杆菌属水平与eWAT重量、脂肪TNF-α和IL6水平、脂肪lpl和结肠tlr-4的表达呈负相关。体重与梭杆菌纲丰度呈负相关，在HFD组中梭杆菌纲的相对丰度最高。疣微菌门丰度与脂肪il-6 mRNA水平呈负相关。除了肝脏重量，结肠tnf-α mRNA水平与肠杆菌科和乳杆菌属的丰度呈显著正相关，而这些细菌的丰度与血浆IL-10水平呈负相关。此外，梭菌纲丰度与脂肪tlr-4 mRNA水平呈正相关，而A. muciniphila与eWAT中il-6表达呈负相关。ALT与病原菌呈正相关，例如罗氏菌属和α-变形菌纲。这些发现表明，施用A. muciniphila可以通过影响HFD诱导的肠道生态失调，在调节宿主反应中发挥有益作用。