关键词：AKK菌、AKK菌与流感病毒、AKK菌格林汁

近期的《免疫学》（Immunity）杂志上的一项研究表明：患者在接种流感疫苗后对流感疫苗产生了免疫反应导致疫苗失效的一个重要原因可能是肠道细菌。

研究背景

    流感是由流感病毒引起的全球性传染病，并且流感病毒具有高度变异性，可以不断重组形成新的亚型，对人类和动物具有高致病性。2013年3月出现的新型禽源性流感A（H7N9）病毒，截至2020年5月已感染1,568例人类病例，造成616例死亡。大量研究证实流感的致病性与肠道微生物群之间具有密切关系，流感感染可以改变肠道微生物群的结构，肠道微生物群的变化也会明显影响流感感染的结果，但是这些关联背后的细节仍有待确定，尤其是关于新出现的流感病毒（如H7N9）与肠道微生物群之间的关系。该研究通过对H7N9感染小鼠的粪便微生物进行16S rRNA测序，分析H7N9感染对小鼠肠道微生物群的影响，并阐明这些影响的可能机制。

研究内容

感染小鼠的粪便微生物分析

     12只雌性C57BL/6小鼠（8周龄）随机分为NC组（阴性对照，使用PBS模拟感染）和H7N9感染组（n=6只小鼠/组）。将含有氯胺酮和甲苯噻嗪（分别为100和5 mg/kg）的100μL无菌PBS混合液腹腔注射麻醉小鼠后，每只小鼠鼻内接种 1×10⁴ EID₅₀ H7N9流感病毒（流感病毒 A/chick/Guangxi/YL01/2017）或等体积的PBS。感染后第0天和第7天收集粪便样本用于后续的总DNA提取和测序。

小鼠抗生素处理

    含有氨苄青霉素（1 g/L）、万古霉素（0.25 g/L）、硫酸新霉素（1 g/L）和链霉素（5 g/L）的抗生素溶液（ATB）添加到小鼠的无菌饮用水中，持续处理3天。Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835（A.muciniphila）灌胃前1天停止ATB处理。

口服灌胃A.muciniphila与小鼠感染

         30只ATB预处理的小鼠被随机分配到三组（n=10只小鼠/组）：PBS组、A.muciniphila组和巴氏杀菌A.muciniphila组。每只小鼠每天口服200 μL PBS或200 μL含有1×10⁸ CFU的活的或巴氏杀菌的A.muciniphila的PBS。8天后，所有小鼠鼻内接种H7N9流感病毒（每只小鼠1×10⁴ EID₅₀）。每天监测小鼠的存活率和体重，持续 15 天（感染后0-14天）。

    另63只ATB预处理的小鼠被随机分配到三组（n=21只小鼠/组）：PBS组、A.muciniphila组和巴氏杀菌A.muciniphila组。灌胃和H7N9病毒感染步骤同上。感染后第0、3、5天采集小鼠肺和血液（每组每个时间点n =5）测定肺病毒滴度和细胞因子浓度。感染后第0天和第6天处死每组额外的小鼠（每个时间点n = 3），收集肺用于组织病理学分析。

    探索A.muciniphila对感染PR8（甲型流感病毒/波多黎各/8/1934，H1N1）流感病毒小鼠的影响，21只ATB预处理的小鼠随机分配到三组（n = 7只小鼠/组）：PBS、A.muciniphila或巴氏杀菌A.muciniphila组。灌胃步骤同上，8天后，每只小鼠鼻内接种1×10³ TCID₅₀的PR8流感病毒。每天监测小鼠的存活率和体重，持续15天（感染后0-14天）。

    研究LPS（从大肠杆菌中分离的脂多糖）对流感感染的影响，21只ATB预处理的小鼠随机分配到三组（n=7只小鼠/组）：PBS（每天口服200 μL PBS）、LPS（每天口服200 μL含与1×10⁸ CFU巴氏杀菌A.muciniphila同剂量的LPS）或巴氏杀菌A. muciniphila（每天口服200 μL含1×10⁸ CFU巴氏杀菌A.muciniphila的PBS）组。8天后，每只小鼠鼻内接种1×10⁴ EID₅₀ H7N9流感病毒。每天监测小鼠的存活率和体重，持续15天（感染后0-14天）。

口服灌胃Lactobacillus gasseri ATCC 33323（L.gasseri）与小鼠感染

        14只ATB预处理的小鼠被随机分配到两组（n=7只小鼠/组）：PBS组和L.gasseri组。每只小鼠每天口服200 μL PBS或200 μL含有1×10⁸ CFU L.gasseri的PBS。8天后，所有小鼠鼻内接种H7N9流感病毒（每只小鼠1×10⁴ EID₅₀）。每天监测小鼠的存活率和体重，持续 15 天（感染后0-14天）。

流感特异性抗体反应的测量

    8只小鼠分为PBS灌胃和巴氏杀菌A.muciniphila灌胃组（n =4/组），灌胃步骤同上，每只小鼠鼻内接种5×10² EID₅₀ H7N9流感病毒（非致死剂量）。感染后14天和21天收集所有小鼠血样通过ELISA测量血清中的流感特异性抗体。

研究结果

H7N9流感病毒感染显着改变小鼠肠道微生物群的组成

    通过16S rRNA测序分析模拟感染小鼠（NC组）和H7N9感染小鼠（H7N9组）的粪便微生物，将所有样本的有效标签与具有97%相似性的OTU（操作分类单元）聚类，并对OTU的代表性序列进行物种注释。基于ANOSIM测试发现，H7N9感染后7天的粪便微生物组成不仅与感染前的粪便相比有变化，而且与NC组的粪便相比也显示出明显的变化。同时，PCoA图和UPGMA分析也表明H7N9感染组小鼠在感染后7天的粪便微生物组与其他组不同。

图上 H7N9流感病毒感染显著改变小鼠肠道微生物群的组成

图下 H7N9感染小鼠和健康对照在门和属水平的粪便微生物群丰度

A.muciniphila和L.gasseri受H7N9感染调节

    在门和属水平上分析与H7N9感染相关的肠道微生物特征的变化，结果发现，在门水平上H7N9感染导致Proteobacteria和Verrucomicrobia的丰度更高，而Bacteroidetes的丰度更低。此外，在属水平上H7N9感染组Akkermansia、Ruminococcus 1、Ruminococcaceae UCG-010、[Eubacterium] ruminantium group、Stenotrophomonas等的丰度较其他组显著增加。相比之下，H7N9感染组中Rikenellaceae RC9 gut group、Lachnoclostridium、Tyzzerella等的丰度下降。

    使用线性判别分析 (LDA) 效应大小 (LEfSe) 方法分析未感染和H7N9感染小鼠的粪便微生物发现，H7N9感染组中A.muciniphila富集，并且有较少的L.gasseri，表明这两种细菌受H7N9感染调节。

图上 LEfSe鉴定的H7N9感染小鼠和健康对照之间具有不同丰度的分类群

图下 口服A.muciniphila改善小鼠H7N9感染的症状

口服A.muciniphila改善H7N9感染的临床症状

15天的小鼠的存活率和体重监测发现，口服A.muciniphila和巴氏杀菌A.muciniphila可提高小鼠的存活率，缓解小鼠体重下降。然而，针对H7N9感染巴氏杀菌的A.muciniphila比活的A.muciniphila具有更好的保护作用。LPS试验表明，口服灌胃LPS的感染小鼠的存活率和体重下降与PBS组几乎相同，消除了LPS的影响。此外，口服灌胃L.gasseri对感染小鼠的影响试验发现，灌胃L.gasseri既没有提高存活率，也没有缓解受感染小鼠的体重下降。这些发现证明A.muciniphila中观察到的影响实际上是特定于该属的，并为A.muciniphila作为抗流感益生菌的潜力提供进一步的证据。

口服巴氏杀菌A.muciniphila抑制体内H7N9病毒的增殖并改善肺部病理

qRT-PCR分析小鼠肺中病毒核蛋白 (NP) 的mRNA水平，结果表明，口服活的或经巴氏消毒的A.muciniphila处理在感染后第5天肺中NP mRNA的表达显著降低。其次，通过接种10日龄SPF鸡胚检测肺中的病毒滴度发现，同样地，在感染后第5天，用活的或巴氏杀菌的A.muciniphila处理的小鼠的肺病毒滴度显著低于仅用PBS处理的小鼠的肺病毒滴度。此外，通过苏木精和伊红染色进行肺组织病理学分析口服A.muciniphila对H7N9感染的肺部病理发现，与A.muciniphila组和巴氏杀菌A.muciniphila组相比，PBS组的肺表现出更严重的炎症细胞浸润、肺泡萎缩和纤维化。

图上 口服A.muciniphila抑制体内H7N9病毒的增殖并改善肺部病理

图下 口服A.muciniphila显著改善H7N9感染小鼠肺部的免疫反应

口服巴氏杀菌A.muciniphila显著改善H7N9感染肺的免疫反应

    通过ELISA测量肺中IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-10和TNF-α的浓度评估A.muciniphila口服给药诱导的细胞因子反应，结果显示，与PBS组相比，活的A.muciniphila或巴氏杀菌的A.muciniphila组在感染后3天或5天小鼠肺内IFN-β、IFN-γ和IL-10水平显著升高。相比之下，肺中的IL-1β和 IL-6在感染后5天显著降低。数据表明，在巴氏消毒A.muciniphila的小鼠肺中IL-6水平较低，IFN-β水平较高。还发现在感染后5天，口服巴氏杀菌A.muciniphila的小鼠血液中IL-6的水平显著降低。此外，与其他两组相比，巴氏杀菌后的A.muciniphila小鼠血液中TNF-α水平显著下调。虽然活的A.muciniphila或巴氏杀菌的A.muciniphila组的血清中IL-1β水平没有变化，但其他细胞因子（IFN-β、IFN-γ和IL-10）水平显著增加，这与肺中的细胞因子水平变化大体一致。此外，在感染后14天和21天检测小鼠血清中流感特异性IgG的滴度发现，PBS组和巴氏杀菌A.muciniphila组之间的流感特异性IgG水平没有差异。这些结果表明，A.muciniphila的口服给药可以提高对H7N9感染的先天免疫反应，A.muciniphila的抗流感作用取决于其抗炎和免疫调节能力。

总结

    该研究描述了与高致病性H7N9流感病毒感染相关的肠道微生物群的改变，更重要的是发现肠道A.muciniphila与流感病毒感染之间存在正相关关系，并进一步证明口服A.muciniphila可以提高宿主对流感病毒的防御，且巴氏杀菌的A.muciniphila对H7N9流感感染具有更好的保护作用。此外，数据表明A.muciniphila的抗流感作用是由于其抗炎和免疫调节特性。该研究不仅丰富了目前关于特定肠道细菌菌株如何预防流感感染的知识，而且还鉴定了一种新型抗流感微生物，从而为抗流感益生菌的开发奠定了基础。